总结 | 各类靶点的PROTAC专利布局概述

导读

今日分享葛兰素史克公司的 Andrew B Benowitz 等人发表在《Expert Opin Ther Pat》上的一篇总结性文章，该文对2013年1月至2020年6月所有已发表的PROTAC PCT 专利首次进行了全面的综述，这些专利涵盖的PROTAC靶点包括核受体、激酶、参与表观遗传的蛋白质以及错误折叠的蛋白质。

Protac技术

PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）是一种双功能小分子化合物，该小分子化合物类似一个跷跷板，一端是结合靶蛋白的配体，另一端是结合E3泛素连接酶的配体，配体之间通过一个linker连接，形成一个复合物，拉近靶蛋白与E3连接酶从而促进靶蛋白的泛素化，使其进入泛素-蛋白酶体降解途径，达到降解靶蛋白的目的。

降解靶点之核受体

核受体结构示意图

核受体是细胞内重要的信号转导机制，在感应刺激配体并响应这些配体调节基因转录方面发挥着关键作用。人们已经清楚地认识到，过量的这些信号配体或核受体突变，导致有害的转录程序激活，这也是导致人类疾病恶化的重要原因，而已批准的对抗这些受体的药物并不能长久的对患者有利。随着目前的研究显示，与拮抗剂相比，通过PROTAC策略降解核受体可能会是一个更加有利的策略。目前已有多篇报道报道了protac介导的用于治疗前列腺癌的雄激素受体(AR)的降解以及用于治疗乳腺癌的雌激素受体(ER)的降解。

雄激素受体（AR）

第二代AR拮抗小分子：1:enzalutamide, 2:apalutamide, 和 3:darolutamide

抑制雄激素受体（androgen receptor, AR）信号通路是治疗前列腺癌的主要方法之一，PROTAC降解AR的策略可以治疗在不存在配体甚至存在拮抗剂的情况下，仍然可能发生的AR信号传导的特殊情况。迄今为止，已发表的PCT专利申请均来自Arvinas和耶鲁大学。AR的PROTAC分子都是基于第二代AR拮抗剂enzalutamide、apalutamide和darolutamide（上图）的衍生物如4-6号、8号化合物以及先前报道的四甲基环丁烷核心AR拮抗剂（如7号化合物）衍生的降解AR的PROTAC。据报道化合物7在VCaP异种移植小鼠模型中具有功效，在以30、10和3mg/kg的每天一次腹腔注射的条件下，观察到肿瘤生长抑制。

一些代表性的降解AR的protac分子

已发表的降解AR的PROTAC专利中，使用的E3连接酶binders主要有VHL binder，IAP binder和cereblon binder。基于VHL和IAP的PROTAC基本都是中效或低效的AR降解剂，而报道的基于cereblon的PROTAC分子细胞内降解AR更加有效。专利文件中显示一些基于cereblon的PROTAC分子（如9-11号化合物）的DC50 <1 nM and Dmax ≥75%。

基于cereblon的PROTAC分子

降解靶点之激酶受体

BCR-ABL激酶以及抑制剂

酪氨酸激酶受体-c-ABL和BCR-ABL

2017年耶鲁大学的一份专利申请文件中展示了一些PROTACs，这些分子可与VHL和cereblon E3连接酶结合，分别连接到已知的FDA批准的激酶抑制剂上（如伊马替尼、博苏替尼和达沙替尼）。Western blot显示，Cereblon-dasatinib(如化合物25，下图)和cereblon-bosutinib PROTAC可以降解K562 CML细胞中的BCR-ABL（白血病致癌基因）融合蛋白和c-ABL表达的受体。而使用VHL binder时，只有基于达沙替尼的PROTAC观察到了c-ABL的降解，且所有基于VHL的化合物都没观察到BCL-ABL的降解。基于伊马替尼的PROTACs没有观察到c-ABL和BCL-ABL的降解。

酪氨酸激酶受体-BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）

BTK降解作为解决BTK抑制的耐药的一种策略，来自耶鲁大学的一份专利申请文件列出了一些降解BTK的PROTAC分子，作为对依鲁替尼耐药的CLL病人的潜在疗法。这份专利中展现了VHL-based和cerenlon-based PROTACs。化合物27是一个基于依鲁替尼以cerebln-binder作为E3连接酶招募基团的PROTAC，化合物27在Namalwa细胞中降解BTK的DC50为9 nM且Dmax大于99%，相较于依鲁替尼它在C481S病人的原代细胞样本中有着更好的效能。

Dana-Farber癌症研究所的一份专利申请文件中给出的一系列化合物基于BTK binders，并且以VHL和cereblon binders作为E3连接酶的招募基团。化合物28在MOLM-14和Ramos B细胞中显示了BTK的降解能力，并且该化合物被报道当QD为50mg/kg时在患者来源的异种移植物MCL小鼠模型中有效。

酪氨酸激酶受体-FAK（局部粘着斑激酶‍‍‍）

来自耶鲁大学和Dana-Farber癌症研究所的专利给出了一些降解FAK的PROTACs分子。耶鲁大学的专利文档中给出了10个化合物，cereblon或VHL binder通过中间PEG的linker连接FAK binder（结构依据defactinib）构成。这些降解FAK的PROTACs的DC50能达到nM的效能，Dmax大于85%。此专利文件中称基于VHL的PROTACs比那些基于cereblon的更加有效，而且中等长度的linkers能给予更好的降解效能。一系列的体外研究表明化合物29相比FAK抑制剂defactinib对FAK信号通路中的靶点有更加显著的作用。专利文件中进一步的数据表明化合物29相比defactinib有着更好的激酶选择性。

Dana-Farber癌症研究所公布的一项专利文件中列出了12个FAK PROTACs，只有一个用了cereblon E3连接酶binders。基于cereblon binders的分子与基于PND-1186的FAK配体通过一些碳和PEG linkers连接。四个化合物在PA-TU-8988T细胞中展现出了显著的降解效果，在10nM就已经有着＞90%的降解。在PA-TU-8988T裸鼠异种移植模型中，以10mg/kg给药化合物30，观察到显著的FAK降解。

酪氨酸激酶受体-PTK6、Wee1和TRK

一份来自西奈山伊坎医学院的专利文件公布了降解PTK6（蛋白酪氨酸激酶6）的化合物希望能用来治疗癌症。这份专利包含约200个PROTACs分子，这些分子既有cereblon binder又有用VHL binder的，通过一系列的linkers与两个公布的PTK6 binder相连接。化合物31在MDA-MB231三阴乳腺癌细胞中能降解PTK6，相比单个PTK6抑制剂，化合物31对ER+乳腺癌和铂耐药卵巢癌细胞有更好的抑制作用。

Wee1激酶通过CDK1的磷酸化在细胞周期中发挥着重要的调控作用，Wee1激酶抑制剂与DNA损伤的癌症疗法联合用药被认为具有治疗癌症的潜力。Dana-Farber癌症研究所的一项专利中公布了降解wee1的化合物，作为潜在的肿瘤治疗策略，专利文件中列出了约20个PROTACs，这些分子由Wee1抑制剂AZD1775和cereblon或VHL binder组成，基于cereblon的PROTACs能够在MOLT4细胞中降解Wee1。尽管AZD1775缺乏对Wee1和PLK1的选择性，使用这些化合物时却没有看到PLK1的降解。其中化合物32是一个有潜力开发的化合物。

PTK6 PROTAC-31；Wee1 PROTAC -32和TRK PROTAC-33的结构

迄今为止，仅有一个酪氨酸受体激酶（TRK）PROTAC在PCT专利文件中报道，由Cullgen公司公布。专利文件中称这些化合物能降解原肌球蛋白受体激酶TRKA，TRKB，TRKC。这份专利主要关注两种疾病适应症：主要由TRK融合蛋白引起的癌症如分泌乳腺癌以及外周疼痛。这份专利文件假定TRK双功能降解剂可能限制在外周，因此不会降解定位在CNS的TRK家族成员，专利文件中列出了超200个TRK PROTACs分子。这些分子由一个VHL或cereblon binder连接一个entrectinib或GNF-8625组成。许多给出的化合物显现出在KM12克隆癌细胞中能降低TPM3-TRKA融合蛋白的水平。一些也能降低AGBL4-TRKB和ETV6-TRKC融合蛋白的水平。三个基于cereblon的PROTACs（包括化合物33），在小鼠K12皮下异种移植模型中能显著降低肿瘤体积。

丝/苏氨酸激酶受体-IRAK4

IRAK4（白细胞介素-1受体相关激酶4）降解PROTAC被假设具有与IRAK4抑制剂不同的特性，并且Arvinas和Kymera Therapeutics公司的IRAK4 PROTAC PCT专利申请已经发表。在Arvinas IRAK4 PROTAC专利文件中，称PROTACs有潜力用于炎症性疾病、肿瘤和神经退行性疾病的治疗，这些PROTAC分子用了VHL、IAP、MDM2 binders，但绝大多数化合物是cereblon-recruiting PROTACs。Western blot检测结果表示，化合物34在MCF7细胞中24h后降解IRAK4的DC50为23nM，Dmax 80%。

Kymera Therapeutics发布的专利文件中包含超500个IRAK4 PROTACs。给出的化合物都是用的cereblon binders。化合物35在OCI-LY10细胞中处理4H和在人源PBMC单核细胞中处理20h的DC50＜10nM。

丝/苏氨酸激酶受体-LRRK2、B-Raf

Dana-Farber癌症研究所发布的专利文件中列出了一系列的LRRK2野生型和突变型的双功能降解剂，有潜力用于治疗PD和脑癌。列出的化合物用了cereblon、VHL binders，大部分都是通过PEG linkers连接到几种LRRK2 binders（如化合物37）。体外实验数据表明化合物与cereblon和LRRK2的结合伴随着LRRK2的降解。然而这些化合物穿梭BBB的证据还没被报道。

Arvinas和Yale大学发表的一份专利文件中包含500多个B-Raf PROTACs，使用了VHL、cereblon binder作为E3连接酶的招募基团。基于B-Raf抑制剂PLX8394的PROTACs是最常见的，PLX8394与早期的B-Raf抑制剂相比具有更好的耐受性。化合物38包含一个基于vemurafenib的B-Raf binder和一个VHL binder，DC50＜10nM，专利中提到它是一个V600E，K601E，G466E B-Raf突变型的选择性降解剂。

丝/苏氨酸激酶受体-RIPK2

三份已发表的RIPK2 PROTACs专利申请均来自葛兰素史克。前两份专利文件给出的分子，以IAP家族E3连接酶作为结合对象，都用了4-氨基喹啉/喹唑林啉作为结合RIPK2的母核。专利中含有用PEG作为linker的化合物(如化合物39)，但大多数例子具有结构更复杂的linkers(如化合物40)。与前两份专利文件不同，第三个发布的专利文件中的PROTACs都是基于cereblon-recruiting的，文件中的化合物在THP1细胞中均有RIPK2降解能力且Dmax >10%，DC50 <1 µM。

丝/苏氨酸激酶受体-CDK

CDK（周期蛋白依赖性蛋白激酶）的过度激活引起细胞增殖的失调，从而促进肿瘤的发生进行。CDK家族靶标的抑制已经在临床上证明能够治疗癌症。已公开的多份专利文件中包含了CDK4/6，CDK8，CDK8/19，CDK9的PROTACs。两份来自Dana-Farber癌症研究所的专利文件中公布了降解CDK4/6的PROTACs。第一份文件中包含了22个用palbociclib, ribociclib and abemaciclib作为靶点结合部分和作为E3连接酶招募部分的泊马度胺连接。化合物45只能降解CDK4，不同的是46号化合物对CDK4和CDK6都能降解。化合物47中泊马度胺由胺连接键变为了醚键。

Wistar解剖和生物学研究所和Thomas Jefferson大学的一项专利申请文件也公布了以palbociclib作为靶标结合部分的CDK4/6 PROTACs。专利中的PROTACs除了基于cereblon的，还有VHL、IAP和MDM2 recruiting的PROTACs。化合物48优先降解CDK6而不是CDK4，并且在异种移植瘤模型中显示具有体内活性。尽管结构与化合物45相似，选择性却与化合物45相反。MDM2-recruiting的化合物49在降解CDK4和CDK6方面效果相同。Dana-Farber癌症研究所后面发布的一系列专利申请文件中包含了降解CDK9、CDK8、CDK19的PROTAC分子。

CDK的protac分子

降解靶点之错误折叠的蛋白

错误折叠的蛋白之-Tau

Arvinas的专利文件中给出的化合物用VHL或cereblon binders通过一个linker与结合过磷酸化的Tau蛋白（PHF-Tau）连接在一起。一些PROTACs由cereblon binder连接一个基于PHF-Tau放射性配体[F-18]-T807的Tau binder组成。这些化合物在SK-N-SH细胞中在11-1000 nM的水平下对Tau的72h降解率超过50%。化合物72体内检测给药8h后小鼠海马体中的Tau降解了约50%。

Dana-Farber Cancer Institute的专利中也同样是既有用cereblon binder的也有用VHL binder的，也是与一个基于[F-18]-T807的Tau binder连接。几种基于cereblon化合物在人类分化的额颞叶痴呆（FTD）神经元中降解Tau，但在非疾病状态对照组神经元中并不降解Tau。

错误折叠的蛋白之-α-synuclein

‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍Arvinas最近的一份专利文件中列出了一些能降解α-synulein（α-突触核蛋白）的PROTAC分子，这些由VHL-binding配体与不同的α-synuclein binder组成。一些代表性的分子（如化合物74）显示出可显著减少HEK293 TREX u-syn A53T细胞中的α-突触核蛋白。

总结

这篇综述首次对2013年1月至2020年6月的治疗性PROTAC PCT专利申请进行了全面综述。文章中讨论了可降解一系列靶标（核受体、激酶、表观遗传过程中的蛋白、错误折叠的蛋白）的PROTACs，还提供了多个涵盖各种E3连接酶招募部分的例子。这篇文章对于对PROTAC感兴趣的、想要了解一些PROTAC的药学相关领域的人以及研究人员将会有很大帮助，想了解更多细节，可阅读原文。

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