双靶点CAR-T细胞！

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2021年3月26日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了蓝鸟生物公司的bb2121（Idecabtagene Vicleucel, ide-cel）作为第一个BCMA CAR-T细胞用于治疗复发性或难治性多发性骨髓瘤（MM）的成年患者。

然而，在使用这种疗法后仍会出现抗原逃逸和肿瘤复发，一些临床试验报告了患者肿瘤细胞BCMA抗原丢失或表达下调。设计同时针对多种抗原的CAR-T疗法似乎是避免抗原逃逸的一种可行方法。

除BCMA外，CD38最近被确定为MM可行的抗原靶点，因为骨髓瘤细胞在不同疾病阶段表现出强大而一致的CD38表达。此外，抗CD38 CAR-T细胞治疗目前也正在临床试验中进行测试（NCT03464916，NCT03754764）。

这里介绍一种同时靶向BCMA和CD38的新型双靶点CAR-T细胞，其在体外表现出比单一靶点CAR-T更高的细胞毒性和增殖能力，有可能克服当前单一靶点CAR-T容易复发的问题。

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 Tan CAR-T细胞

BCMA-OR-CD38-Tan-CAR或CD38-OR-BCMA-Tan-CAR的抗原结合域由抗BCMA单链抗体（VL连接子VH）和抗CD38单链抗体（VH连接子VL）组成，通过连接肽（Gly₄Ser）₄串联连接。

BCMA-OR-CD38-Tan-CAR+T的转导效率为85.7%，CD38-OR-BCMA-Tan-CAR+T为74.0%，BCMA-CAR+T为78.2%，CD38-CAR+T为87.3%。Tan-CAR的表达效率与BCMA-CAR或CD38-CAR相似，这意味着这种双抗原CAR修饰的靶向性并不影响这种CAR的转导效率。

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 Tan CAR-T的细胞毒性

为了评估Tan-CART细胞对骨髓瘤细胞的特异性细胞毒性，将BCMA-OR-CD38 Tan-CAR-T、CD38-OR-BCMA-Tan-CAR-T、BCMA-CAR-T、CD38-CAR-T和Pan-T细胞分别与BCMA-K562或CD38-Raji细胞共孵育8小时。Annexin-V染色检测肿瘤细胞凋亡。

TanCAR-T细胞对BCMA-K652和CD38-Raji细胞显示出显著的细胞毒性，而单靶向CAR-T细胞仅分别对BCMA+或CD38+靶细胞产生反应。值得注意的是，BCMA-OR-CD38-Tan-CAR-T的细胞毒性显著高于CD38-OR-BCMA-Tan-CAR-T细胞。

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Tan CAR-T细胞的增殖反应

用CFSE标记CAR-T和Pan-T细胞，并与BCMA-K562+CD38-Raji（1:1混合）或PRMI-Luc细胞共培养，通过流式细胞术评价T细胞的增殖反应。

结果表明，Tan-CAR-T细胞，尤其是BCMA-OR-CD38 Tan-CAR T细胞，其增殖显著高于单个靶向的CAR-T细胞和CD38-OR-BCMA-Tan-CAR T细胞。此外，无靶细胞刺激的T细胞增殖和存活曲线表明，Tan CAR-T细胞增殖的程度与单一靶向CAR-T细胞相似。

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Tan CAR-T细胞的体内活性

从体外试验来看，BCMA-OR-CD38-TanCAR-T细胞比CD38-OR-BCMA-TanCAR-T细胞具有更强的抗肿瘤和增殖活性。接下来评估BCMA-OR-CD38-Tan CAR-T细胞在异种移植瘤小鼠模型中对多发性骨髓瘤细胞的疗效。

肿瘤注射后，将肿瘤大小相似的荷瘤小鼠随机分为5组，并在第12天和第19天静脉注射Pan-T、BCMA-CAR-T、CD38-CAR-T或BCMA-Tan-CAR-T细胞。

生物发光成像显示，单个靶向CAR-T细胞或BCMA-or-CD38-Tan CAR-T细胞在第23天产生完全的肿瘤清除。

值得注意的是，在第二次CAR-T注射后两周，测量血清中的IFN-γ水平，发现BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞治疗的小鼠明显高于单一靶向CAR-T细胞治疗的小鼠。此外，通过检测外周血中CD3+T细胞的百分比来评估CAR-T细胞的扩增。结果表明，与Pan-T或CD38-CAR-T细胞相比，BCMA-T或CD38-Tan-CAR-T细胞在小鼠体内经历了更广泛的扩增。

最后，生存率结果表明， Tan CAR-T细胞治疗组的小鼠的中位生存时间明显长于未治疗组或Pan-T组。然而，与单一靶向CAR-T细胞之间没有显著差异。