一些有意思的双靶点CAR开发策略

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一些有意思的双靶点CAR开发策略

开发双靶点CAR的意义

CAR-T在B细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤等血液肿瘤方面取得了革命性的成果，但也面临很多困难和挑战，限制了它进一步提高疗效，或者是拓展到更多的适应症。

CAR-T开发面临的主要挑战：

①靶点逃逸导致的复发；

②靶点表达特异性不足，引发的on target/ off tumor效应产生的毒性，这一点在实体瘤上尤其显著，找一个足够安全有效的靶点太难；

③肿瘤微环境对CAR-T浸润和发挥杀伤作用的限制，主要还在实体瘤上；

④生产成本高昂，进一步限制了可及性。

双靶点CAR主要是为了解决前面两个问题来进行开发。

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开发双靶点CAR的方案

同时靶向2个或更多的肿瘤相关抗原，以防止靶点逃逸，或者覆盖更多患者，实现更好的治疗效果。大致有4种不同的做法：

①序贯治疗。最简单的把两个CAR序贯治疗或者合并一起回输，不需要开发，两个产品去序贯，可灵活调整组合和剂量。缺点也比较明显：生产成本高（2个产品），从临床的实践上来观察，两个CAR-T一起回输或者序贯回输，可能某一靶点CAR起主要作用。

②并联结构。双顺反子结构，在一个细胞上表达两个CAR-T。CAR分子比较大导致病毒包装或者转导的效率容易出问题，两个胞内信号更容易出现耗竭的情况。

③共转导。用两个病毒做共转导，这样一个CAR-T的产品，也可以实现双靶向的概念。但细胞产品比较复杂，有单靶点CAR-T，双靶点CAR-T，还有没有转上的T细胞，质控比较困难。

④串联结构。胞内段是唯一的，胞外识别结构域上串联的结构。但胞外结构复杂，两个单链抗体串起来，结构开发难度大。

图1 双靶点CAR技术方案

（https://doi.org/10.3390/cancers12092523）

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双靶点CAR的临床案例

21年在nature medicine上发表的一篇Ⅰ期临床，开发了CD19和CD22的双靶点CAR，做了两种适应症，一种是B细胞急性淋巴细胞白血病，还有一种是B细胞淋巴瘤。CD19和CD22嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在复发或难治性B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中显示出有希望的疗效，而在B细胞淋巴瘤上效果还不如单靶点CD19 CAR-T。临床的数据显示 CR的比例确实不是很高，复发的一些病人CD19的表达有一些是下降，有一些依然还是很高的，CD22基本上都没有下降，有的还上调了。说明大部分的复发是抗原阳性的复发。从CAR-T扩增的程序上来说，扩增效果还不错，但总体来说疗效比较差。

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图2 NCT03233854产品的临床数据

（https://doi.org/10.1038/s41591-021-01497-1）

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有意思的临床前双靶点CAR开发思路

① Binder通常是抗体，但也有其他情况

2022年发表在nature communication上的一篇文章，作者利用B细胞激活因子（BAFF），开发了一种基于BAFF配体的嵌合抗原受体（CAR）。BAFF结合三种受体BAFF-R，BCMA和TACI，主要在成熟B细胞上表达。据报道，几乎所有的B细胞肿瘤都表达至少一种这些受体。用BAFF作为胞外识别结构域，相当于可以同时靶向这三个不同的抗原，这样在治疗套细胞淋巴瘤（MCL），多发性骨髓瘤（MM）和急性淋巴细胞白血病（ALL）时，相当于一个三靶向的CAR-T，但胞外只有BAFF一个结构域，三个靶点之间在生物学上有很高的相关性，确实可以起到一个协同多靶向的作用，但这还是一个临床前的文章，不知道后面是否有好的药效支持产品的开发。

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图3 靶向三种受体和多种B细胞肿瘤的一种基于BAFF配体的CAR-T细胞

（https://doi.org/10.1038/s41467-021-27853-w）

其中一种就能起作用，起到防止药物逃逸，抗原丢失，大多处于临床前的阶段，非常有意思。

② Split CAR

2020年发表在Blood上的一篇文章开发了一种顺序肿瘤选择抗体和抗原检索（STAR）系统，以快速分离多个纳米抗体（Nbs）。这些纳米抗体优先结合AML细胞并使CAR T细胞具有抗AML功效。CAR构建体具有外泌结构域，通常由来自单克隆抗体（mAb）的单链可变片段（scFv）组成，通过跨膜结构域锚定在细胞上，然后是细胞内共刺激性4-1BB和/或CD28结构域以及CD3z信号结构域，两者激活才能起到较好得杀伤作用。比如STAR分离的Nb157特异性结合CD13，另一个连上TIM3。造血干细胞中只表达CD13，只有在淋巴肿瘤的干细胞上CD13和TIM3同时表达才被激活发挥作用。CD13 CAR-T细胞在体外和体内有效消除AML。CAR-T细胞对CD13和TIM3的双特异性，在AML白血病干细胞中上调，根除了患者来源的AML，在小鼠模型中对人类骨髓干细胞和外周骨髓细胞的毒性大大降低，但人体情况要比动物复杂得多，可能不能控制副作用。

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图4 改善AML中CAR-T细胞的双特异性方法

（https://doi.org/10.1182/blood.2019002779）

③ synNotch “AND” CAR

识别精度的改善促使CAR-T治疗成为未来精准肿瘤治疗的主流手段，16年的Cell报道提高肿瘤识别准确性并排除误杀正常细胞毒副作用的CAR-T设计方案。设计识别抗原A的人工受体synNotch基因，包含抗原A的识别基因片段以及启动抗原B识别CAR基因转录的转录因子。SynNotch的系统就是只有同时表达抗原A和B的肿瘤细胞才被识别和杀伤。

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图5 工程化表达双受体的CAR-T以形成抗原识别环路增加肿瘤杀伤准确性

（https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.011）

④ Inhibitory CAR

13年发表在Science translational medicine的一篇文章解决了另一个问题，识别肿瘤和非肿瘤。当在肿瘤上表达的抗原在正常细胞上也表达，那怎么能够实现双靶点CAR能够识别肿瘤细胞而不杀伤正常细胞呢？开发了一种抑制型的CAR-T，在CAR-T细胞中同时表达CAR和iCAR。iCAR是经过改造的抑制性受体（如PD-1和CTLA-4），能够识别正常组织呈递的抗原。这样在和正常组织接触时，CAR-T细胞的活性被抑制，而只有在和癌细胞接触时，CAR-T细胞才能被激活，发挥杀伤作用。

图6 基于PD-1和CTLA-4的抑制性嵌合抗原受体（iCAR）

（https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3006597）

⑤一种比较新颖的抗体形式

人源的单域抗体来开发双靶点CAR，免疫原性比羊驼低，串联结构简单，可像纳米抗体一样串在一起，不会影响相互的功能，没有轻链重链。这篇发表在STTT上的文章， CD5/CD7双靶点CAR-T敲除CD5和CD7可防止CD5/CD7双特异性CAR-T细胞自相残杀，其在单阳的细胞上有很好的杀伤作用；在混合肿瘤模型（单阳、双阳细胞）上都有很好的肿瘤抑制效果。体内CAR-T的扩增情况看，串联（紫色和绿色）扩增更好一些。整体上看，串联双靶向CAR 在杀伤活性和防止肿瘤逃逸方面比并联双靶向CAR更有效。

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图7 CD5/CD7双靶点CAR-T

(https://doi.org/10.1038/s41392-022-00898-z)

总体来说，双靶点CAR开发处在比较早期的阶段，道阻且长，所以有时候效果还不如单靶点CAR，甚至有时1+1<1。但是前赴后继的临床前研究和临床数据，积累组合靶点、结构开发和抗体种类选择等的经验，我们相信双靶点CAR会有一个的光明的未来。

主要参考文献

1 Cronk, R.J.; Zurko, J.; Shah, N.N. Bispecific Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for B Cell Malignancies and Multiple Myeloma.Cancers 2020, 12, 2523. https://doi.org/10.3390/cancers12092523

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4 Roybal, Kole T et al. “Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits.”Cell vol. 164,4 (2016): 770-9. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.011

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7 Dai, Zhenyu et al. “T cells expressing CD5/CD7 bispecific chimeric antigen receptors with fully human heavy-chain-only domains mitigate tumor antigen escape.” Signal transduction and targeted therapy vol. 7,1 85. 25 Mar. 2022.https://doi.org/10.1038/s41392-022-00898-z